Трансгенные растения и пчёлы

Успехи в изучении дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК), специфично свойственных большинству организмов и участвующих в передаче признаков родителей своему потомству, привели в 1972 г. к возникновению генной инженерии — получению организмов с заранее определёнными планируемыми свойствами путём встраивания в ДНК одного организма участков ДНК (генов) другого. В 80-е годы эту возможность стали интенсивно использовать для повышения урожайности в растениеводстве, добиваясь устойчивости растений к вредителям и успехов в борьбе с сорняками. В 1996 г. на рынке появились семена трансгенных растений, посевы которых во всём мире уже к 1998 году достигли 70 млн га. В США для выращивания разрешено 40 разновидностей сельскохозяйственных культур, в Европе — 21. Испытанию подвергаются более 25 тыс различных растений, включая полевые культуры (соя, кукуруза, хлопок, масличный рапс, рис, табак, люцерна), садовые (яблоки, киви, папайя, клюква, виноград, слива, малина, земляника, дыня), овощные (томаты, кабачки, горох, морковь, огурцы, баклажаны, брокколи) и цветочные (гладиолусы, петунии, хризантемы).

 Широкомасштабное внесение трансгенных растений в природу имеет большое значение для тесно связанных с растениями медоносных пчёл и других насекомых-опылителей.

 Практика использования таких растений показывает «миграцию» их генов с пыльцой на нетрансгенные растения, независимо от того, относятся ли они к ветро- или насекомоопыляемым. При этом распространение пыльцы бывает значительным. Пыльца кукурузы за 2 часа (период сохранения оплодотворяющей способности) может разноситься ветром на 32 км (М.С. Соколов и др., 2002). Пыльца трансгенного рапса попадает на нетрансгенные растения на расстоянии до 2 км. Связанные с растениями насекомые также активно участвуют в переносе пыльцы. Обилие диких опылителей на цветках трансгенных и нетрансгенных сортов рапса (Canola) в Канаде не имело различий (A. King et al., 2005). Люцерновая пчела Megahile rotundata способна переносить пыльцу трансгенной люцерны между полями на расстояние до 1000 метров (P. Benedeck, 2002). Наблюдения в Южной Америке показали, что медоносные пчёлы участвуют в переносе пыльцы трансгенной сои на нетрансгенные растения в 96,26% случаев на открытых участках и в изоляторах (W.C.C. Chiari et al., 2005). Особо важное значение в переносе пыльцы играют пчёлы на посевах трансгенного рапса (J. Ramsay et al., 2005). Поведение пчёл на изменённом и обычном рапсе было одинаковым (A. L. Picard-Nizou et al., 1995). Они способны активно переносить пыльцу трансгенного зимнего и весеннего рапса на различные сорняки, присутствующие в посевах (J. H. Williams, 2001; J.B. Osborne et al., 2001; F. Anchling, 2001).

При переопылении трансгенных и немодифицированных сортов растений происходит не только встраивание в геном последних чужеродного гена, удалить который невозможно, но и вытеснение такими растениями неизменных, как менее приспособленных сортов, что приводит к потере популяционного и генетического разнообразия (А. С. Баранов, 2002). За счёт переопыления возможно скрещивание близких видов, например, рапса с сорняками (дикой горчицей), являющихся хорошим источником нектара и пыльцы для пчёл.

 Проведённые четырёхлетние наблюдения за полями гербицидоустойчивых трансгенных культур в 200 местах Великобритании показали чёткие различия в популяциях сорняков, снижение числа пчёл и бабочек, посещающих виды растений (цветы), растущие по краям полей. (H. Walker, J.L. Osborse, 2005). Спонтанное распространение пыльцы трансгенных растений имеет и другие отрицательные примеры. Попадание пыльцы трансгенного риса на листья шелковицы, которой обсаживаются рисовые чеки в Китае, привело к гибели тутового шелкопряда на выкормках. Природные популяции предковых форм кукурузы в Мексике и прилегающих районах Гватемалы, риса в Индии оказались насыщенными трансгенными продуктами. Встроенный ген токсинов в сорт кукурузы Starleih, разрешённый для производства кормов и непродовольственных товаров в США, в 2000 г. был выявлен в сортах кукурузы, используемых для питания человека (М. С. Соколов и др., 2002; А. М. Куликов, Т. С. Серебринская, 2002).

 Согласно регламенту EG 49/2000 от 10 апреля 2000 г. в Европе продаваемые семена должны быть маркированы при наличии в них 0,3–0,5% примесей семян трансгенных растений, в силу того, что агропромышленный сектор и операторы рынка не в состоянии обеспечить отсутствие загрязнения (М. С. Вонский и др., 2002).

Не менее важной проблемой для пчеловодства является непредвиденное возникновение плейотропного (множественного) эффекта у растений при встраивании целевого трансгена в их геном, нарушение функции генов в прилегающей к точке интеграции, вызывающие изменения белков, кодируемых трансгенами (М. С. Соколов и др., 2002). Это отмечается у всех видов растений и может приводить к возникновению небезопасных для пчёл гликоалкалоидов и целому ряду других изменений, включая, очевидно, и возникновение непереваримости пыльцевых зёрен. Фактически такие растения нельзя удалить при селекции линий, что потребует постоянного или периодического контроля существующей медоносной флоры в той или иной местности на способность поддерживать жизнедеятельность пчёл.

 Прямое действие трансгенов отмечают при поступлении кодированных ими белков с пыльцой, нектаром и секретами (смолы, камеди) растений в организм пчёл. Воздействие связано с природой трансгеного продукта и его количеством. Наибольшее количество белка обычно содержится в пыльце, а в нектаре и секретах растений оно незначительно. Однако распределение трансгена в растении неравномерно: например, в пыльце трансгенного хлопка содержится 0,6 мкг токсина, а в клетках цветка – 3,4 мкг/г сырого веса (J. Yreenplate, 1997). К сожалению, публикаций по содержанию трансгенов в пыльце и нектаре немного, а по секретам растений они отсутствуют. Изучение их действия на полезную энтомофауну, включая медоносных пчёл, в значительной степени отстаёт от работ, проводимых в этом направлении в растениеводстве. Обобщённые данные по влиянию этих продуктов на пчёл и шмелей представлены в обзоре J. A. Malone, M. H. Pham-Delegue, 2001. Создатели трансгенных растений прежде всего обратили внимание на хорошо изученную почвенную бактерию Bacillus thuringiensis (Bt), продуцирующую комплекс инсектицидных токсических белков. Отдельные токсины известных 50 подвидов этого микроорганизма обычно специфичны для определённого отряда насекомых, хотя нередко бактериальная клетка производит несколько токсинов, действующих на различные группы насекомых. Здесь требуется тщательный отбор штаммов. Для пчёл могут представлять большую опасность токсины, действующие против перепончатокрылых. Участок цепочки ДНК (ген), кодирующий кристаллический инсектицидный белок (Cry) этой бактерии, принято обозначать цифрой и латинскими буквами.

Очищенный Bt-токсин Cry IAC, активный против бабочек в хлопке в концентрации 20 мкг/мл сахарного сиропа, достоверно не влиял на продолжительность жизни при скармливании личинкам и взрослым 1–3-дневным пчёлам. Концентрация токсина была в 100 раз выше, чем с пыльце и нектаре хлопка в июле (Sims, 1995). Так же нетоксичными для пчёл были концентрации этого токсина, превышающие его содержание в пыльце трансгенного хлопка в 1700 раз и в нектаре в 10000 раз. Используемый в томатах против жуков Bt-токсин Cry 3A также оказался нетоксичен для личинок пчёл. Очищенный Bt-токсин Cry 3В в этих растениях против той же группы вредителей при скармливании с сахарным сиропом в концентрациях 0,016% и 0,332% более двух месяцев не снижал выживание личинок и сухой вес куколок в семьях пчёл (S. Arpaia, 1996).

Отсутствие токсичности для личинок пчёл показали Bt-токсин Cry 1Aв и Cry 9С, направленные против бабочек в кукурузе (Anon, 2000). При содержании опытных семей в изоляторах на посевах трансгенной кукурузы у личинок рабочих пчёл перед окукливанием было обнаружено 17202310 зёрен пыльцы этого растения, или 1,52–2,04 мг/личинку. Полностью переваренными зёрна были в 74,5%, частично переварены – 23,3%, непереваренные – в 2,2% случаев. За счёт пыльцы личинки получили менее 5% белка относительно общего количества протеина, необходимого для полного развития (D. Babendreier et al., 2004), остальное количество белка поступило от пчёл-кормилиц. Bt пыльца кукурузы и Bt токсин Cry 1Ab в концентрации 0,0015% весового объёма не влияли на выживание и развитие гипофарингиальных желёз при скармливании молодым рабочим пчёлам. В железах пчёл были установлены следы токсина лишь в случае непосредственного его внесения в корм (D. Babendreier et al., 2005, 2005а). Исследователи делают вывод, что Bt пыльца кукурузы с Bt токсином безопасны для пчёл (D. Babendreier et al., 2003). Размещение семей пчёл в изоляторах на трансгенной кукурузе (с высоким содержанием Bt токсина IAb) в Германии не влияло на продолжительность жизни взрослых пчёл, развитие расплода и частоту фуражирования в течение 7 дней. Действие на расплод отсутствовало и в последующие 30 дней наблюдения.

 Скармливание молодым пчёлам в течение 7 дней 10, 2,5 или 0,25 мг/г корма с пыльцой очищенного Bt токсина Cry 1В, используемого в трансгенной кукурузе против чешуекрылых, не влияло на степень потребления ими корма и продолжительность их жизни. Пчёлы, получавшие 625 мкг аналогичного токсина с пыльцой и через 7 дней возвращённые в свои ульи, сохраняли время первого облёта, его продолжительность и длительность жизни подобно контрольным (J.A. Malone et al., 2001). 0,3% Cry IBa не влияли на средний диаметр долей гипофарингиальных желёз, их массу, содержание белка в теле и потребление корма пчёлами.

 Таким образом, Bt-гены, кодирующие образование токсических белков в трансгенных хлопке, кукурузе и томатах, оказались безопасными в поставленных опытах для пчёл и, очевидно, для шмелей. Встраиваемыми генами в растениях могут быть участки, кодирующие белки-ингибиторы протеиназ, которые подавляют протеолитические ферменты пищеварительного тракта. В результате этого вредители не в состоянии переваривать белки и погибают от голодания. Ингибиторы протеиназ могут быть изолированы из растений, животных и насекомых. Они воздействуют на специфические протеиназы: цистеин- и серин-протеазы или обладают двойным действием. У пчёл преобладают серин-протеазы. При потреблении 25% белка с пыльцой пчела получает от 0,04% до 4% ингибитора протеаз из трансгенного растения. Данные по содержанию этой группы трансгенов в пыльце и нектаре отсутствуют. Очищенный соевый ингибитор трипсина Bowman-Birk (BBI) испытывался в основном на старых, фуражирующих пчёлах. Концентрации 1,0; 0,1; 0,01 и 0,001 мг/г сахарного сиропа не влияли на продолжительность жизни 7- и 15-дневных пчёл при наблюдении в течение 4-х дней (96 часов); при длительном наблюдении концентрации 1 и 0,1 мг/мл сиропа приводят к увеличению смертности, снижению активности трипсина и химотрипсина в кишечнике, изменяют рефлекс вытягивания хоботка пчелой на корм, снижают способность пчёл к сбору нектара. Потеря рефлекса сохранялась в течение 13 дней у 15-дневных пчёл после скармливания им 26 мкг/мл корма, а при концентрации 1 мг/мл утеря рефлекса продолжалась 15 дней (L. Jouanin et al., 1998; J.A. Malone, M-H Pham delegue, 2001, и др.).

Соевый ингибитор трипсина Kunitz (SBTJ) в лабораторных опытах при концентрации 1% увеличивал гибель личинок пчёл, снижал развитие их и выходящих из ячеек пчёл (H.F. Brodsgaard et al., 2001, 2003). В концентрациях 10, 5 или 1 мг/мл сахарного сиропа он приводил к ускоренной гибели молодых пчёл, влияя на потребление корма, снижал активность эндопептидаз (трипсин, химотрипсин, эластаза) кишечника; экзопептидаза (лейцин-аминопептидаза) достоверно возрастала при всех скармливаемых концентрациях. Концентрации 0,1 и 0,01 мг/мл охотно потреблялись пчёлами, при кратковременном наблюдении продолжительность их жизни не изменялась, но со временем при 0,1 мг/мл сокращалась их жизнь за счёт компенсаторного восстановления протеиназ средней кишки в результате использования аминокислот белков тела пчелы. 0,1 и 1% SBTJ за 10 дней достоверно снижали средний вес и диаметр долек гипофарингиальных желёз рабочих пчёл (D. Babendreier, 2003; D. Babendreier et al., 2005, 2005a). При высоких дозах (10 мг/г пыльцы) отмечен низкий поведенческий рефлекс на корм. Ингибитор снижал продолжительность жизни шмелей, подавлял эластазоподобную активность и химотрипсин, снижал уровень трипсина кишечника, но лейцин-аминопептидаза не изменялась (L.A. Malone et al., 2001; L.A. Malone, M.H. Pham-Delegue, 2001). Апротинин – ингибитор панкреатического трипсина от крупного рогатого скота (BPTJ) снижал выживание пчёл при концентрациях 10, 5 или 1 мг/мл сахарного сиропа, но не влиял при 0,1 и 0,01 мг/мл. Лейцин-аминопептидаза в кишечнике возрастала, а эндопептидаза снижалась на 8 день при всех концентрациях. В концентрации 1,25% апротинин не оказывал влияния на средний диаметр и массу гипофарингиальных желёз пчёл, а также содержание белка в их теле (L.A. Malone et al., 2004). Вышедшие из ячеек пчёлы, получавшие в течение 7 дней 2,5 мг/г апротинина в корм с пыльцой и в дальнейшем помещённые в улей, совершают вылет на 3 дня раньше и живут на 3 дня меньше контрольных (L.A. Malone et al., 2001). Действия его на шмелей отмечено не было.

 Ингибитор трипсина из коровьего гороха (Vigna sinensis) (CpTJ) при скармливании 11 мкг/пчелу и инъекции 0,5 мкг/пчелу не влиял на выживание в течение 24 и 48 часов 10-дневных пчёл. В дозах 1, 5 и 10 мкг/мл сахарного сиропа снижал обонятельный рефлекс пчёл (L.A. Malone, M-H Pham-Delegue, 2001). Ингибиторы протеиназы I и II из томатов (РОТ-1 и РОТ-2) в концентрациях 2 мг/г пыльцы и 0,1 мг/мл сиропа не влияют на продолжительность жизни при кратковременном наблюдении. 2 мг/мл сиропа и 10 мг/г пыльцы РОТ-1 снижал активность трипсина и химотрипсина в средней кишке, но не изменял эластазу на 8 день после скармливания молодым пчёлам, в пыльце препарат действовал сильнее, чем в сиропе.

РОТ-2 достоверно снижал все эндопептидазы на 3 и 8 день независимо от дозы и корма. Потребление корма зависело от концентрации трансгена РОТ-1 (10 и 5 мг/г пыльцы, достоверно снижая выживаемость шмелей. РОТ-2 при концентрации 10 мг/г пыльцы больше влиял на смертность, чем при 0,1 и 0,01 мг/г (L.A. Malone, M-H Pham-Delegue, 2001). Оризацистатин I (OC-I) и цистатин яичного белка при 24 часовом скармливании 15-дневным пчёлам в дозе 11 мкг не приводил к гибели 96 часов. OC-I в концентрациях 1, 0,1 и 0,01 мг/мл сахарного сиропа не влиял на длительность жизни двухдневных пчёл при кратковременном и длительном наблюдении за ними. Но смесь OC-I/BBJ при высоких концентрациях вызывала их гибель. Испытания в облётнике на 5 сортах генно-модифицированного (OC-I) масличного рапса и нормального рапса показало отсутствие различий в посещении пчёлами культур, продолжительности визита, среднего времени, затрачиваемого пчелой на цветок (L.A. Malone, M-H Pham-Delegue, 2001).

Следовательно, находящиеся в трансгенных растениях некоторые ингибиторы протеиназы в испытываемых концентрациях были опасны для пчёл. Необходимо дальнейшее их изучение, определение концентрации трансгенов в различных частях растений, полевые опыты с пчёлами. Влияние других синтезируемых трансгенными растениями белков на пчёл изучено ещё более слабо. Гены, кодирующие хитиноразрушающие энзимы (хитиназа) изолированы из растений, насекомых и энтомопатогенных микроорганизмов. Хитин является важным компонентом насекомых и грибов. При скармливании 10-дневным пчёлам в течение суток 11 мкг хитиназы и инъекции им 1,6-9 мкг/пчелу насекомые жили в течение 24 и 48 часов. Пчёлы, получавшие 1, 5 и 10 мкг/мл в сахарном сиропе, сохраняли рефлекс вытягивания хоботка на корм. В облётнике они одинаково брали чистый сахарный сироп и сироп с добавлением 1,3 мг/мл хитиназы, но число посещений при разведении хитиназы в 100 и 1000 раз было в 4 раза ниже, хотя различий в весе собранного продукта не установлено. На трансгенном масличном рапсе количество визитов, время пребывания на цветке и количество собранного нектара не отличалось от контрольных растений. К сожалению, отсутствуют данные влияния хитиназы на расплод пчёл, где отрицательный эффект наиболее вероятен. Гены, кодирующие бета-1,3 глюконазу, изолированы из большинства растений в ответ на поражения грибами, а также из микроорганизмов. Скармливание 11 мкг/пчелу и инъекция 0,3 мкг/пчелу не влияло на выживание насекомых при наблюдении 24 и 48 часов. Однако скармливание 1, 5 или 10 мкг/мл в сахарном сиропе приводит к затуханию рефлекса вытягивания хоботка на корм с повышением концентрации фермента. Посещаемость пчёлами растворов сахарного сиропа с 110 мкг/мл глюконазы при разведении в 100 и 10000 раз была ниже, чем при высоких концентрациях, хотя количество собранного продукта не отличалось от контроля.

 Потенциальным трансгенным продуктом против насекомых-вредителей растений могут быть биотин-связанные белки, из них известны: авидин из цыплят и стрептовидин из бактерий. Пыльца естественных растений содержит этот витамин в количестве 0,16–2,4 микромоля; в перге – 1,83 микромоль. Скармливание пчёлам 6, 7, 11,2 или 20 микрограммов авидина с пыльцой не влияло на потребление корма, продолжительность их жизни, средний диаметр и массу гипофарингиальных желёз, содержание белка в теле. Личинки, получавшие в первые два дня 164 мкг авидина в 1 мг пыльцы, а в дальнейшем 880 мкг/мг, выживали и развивались нормально (L.A. Malone, M-H Pham-Delegue, 2001; L.A. Malone et al., 2002, 2004). Для борьбы с сорняками в трансгенные растения вводится ген, кодирующий белок глюфозинат-энзим, разлагающий гербициды. Трансгенный гербицидоустойчивый масличный рапс в сравнении с обычным рапсом в изоляторах не влиял на смертность рабочих пчёл, активность фуражирования, предпочитаемость растений, состояние семей пчёл (популяция взрослых насекомых, расплод, наличие болезней, величину хранящихся кормовых запасов) (N. Chaline et al., 1999). К перспективным также относятся гены, кодирующие лектины и яды пауков (L.A. Malone, M-H Pham-Delegue, 2001). Данные по влиянию на опылителей генов рекомбинантных вакцин для предупреждения заболеваний человека (холера, полиомиелит, токсоплазмоз), сконструированных на базе бананов и особенно помидор, при выращивании которых для опыления используют пчёл и шмелей, отсутствуют. В связи с трансгенными растениями остро встаёт вопрос о продуктах пчеловодства. Согласно регламента ЕС 49/2000 продукты питания, содержащие менее 1% генно-модифицированных компонентов, не маркируются. Мёд, по мнению S. Bogdanov et al., 2003, содержит 0,1% пыльцы и в связи с этим не требует проведения специальных исследований на наличие трансгенного продукта. Однако при этом не учитывается возможность попадания их из нектара. Вместе с тем исследования, проведённые в Германии, показали возможность попадания в мёд трансгенных продуктов и иным путём. При изучении 10 образцов шести марок специально готовящихся подкормок для пчёл, куда в качестве источника белка добавляли соевую муку, в 5 образцов продуктов  выявлены генно-изменённые материалы в пределах допустимых норм (менее 1%). Микроскопия центрифужных осадков 389 проб мёда показало наличие в 23 (5,9%) пробах характерных для соевых бобов фрагментов в виде «рыбных чешуек». В результате дальнейших исследований 19 таких проб мёда в 11 установлен трансгенный материал (R. Siede et al., 2005). Открытыми остаются вопросы о влиянии трансгенных продуктов на степень зрелости цветочного мёда, его показатели инвертазы, диастазы (амилазы), сахаров; нет данных по падевым медам. Безусловному исследованию на наличие трансгенов должны подвергаться заготавливаемые, особенно в зонах использования трансгенных растений, пыльца и перга, используемые в пищу человеком и для подкормки пчёл, шмелей, изготовления для них кормов. Совершенно не изучено попадание трансгенных продуктов в прополис, маточное молочко, их влияние на пчелиный яд и воск, в настоящем широко используемые в медицине. Мировой опыт показывает, что крестьянские хозяйства нередко сеют дешёвые семена фуражного трансгенного зерна (кукуруза), не предназначенного для использования в продуктах питания. Определение действия трансгенных растений на пчёл и других насекомых-опылителей строится на данных лабораторных опытов с чистым трансгенным продуктом, подобных изучению действия химических пестицидов и полевых наблюдений. Характер опытов зависит от природы трансгена и его действия. Основным объектом исследования является пыльца, хотя необходимы также данные по нектару, секретам (смолы, камедь) растений, выделениям афид, используемым пчёлами при сборе пади. Важно знать распределение трансгена в этих продуктах, что позволяет ориентироваться в выбранных дозах. Следует учитывать особенности потребления и пищеварения насекомых. Пыльца необходима личинкам пчёл с 3-дневного возраста, потребление её идёт в возрастающем объёме до момента запечатывания ячейки сота. Этот продукт важен для молодых взрослых пчёл, вышедших из куколок для развития и функционирования их желёз, в том числе гипофарингиальных, секретом которых они выкармливают молодых личинок рабочих пчёл, трутней и матку. Выделяемая железами инвертаза и амилаза используются пчёлами для переработки нектара в мёд. От своевременного поступления полноценной пыльцы в улей зависят функционирование восковых желёз и воскострои-тельная деятельность пчёл. Поступающие в организм молодых пчёл белки важны для построения защитных белков гемолимфы (лизоцим, апидицины и др.), жирового тела, определяющего длительность жизни, особенно в период зимовки и для последующего весеннего развития семьи. С переходом пчёл к лётной деятельности в поле насекомые используют уже накопленные белки тела и потребление пыльцы практически прекращается, однако начало яйцекладки маткой весной зависит от хранящихся запасов перги в улье. Шмели питаются пыльцой в течение всей жизни.

Единая разработанная методика по исследованию влияния трансгенных растений на пчёл (шмелей) отсутствует. Имеющиеся экспериментальные данные и наблюдения по влиянию трансгенов на пчёл отрывочны и неполны. Отсутствуют сведения по длительному воздействию сублетальных доз трансгенных продуктов на подготовку и способность к зимовке семей пчёл, их последующее развитие, их влияние на клеточные и гуморальные факторы иммунитета у пчёл, воздействия на матку и трутней. Одним из открытых вопросов является влияние трансгенных растений на микрофлору. Так, одно растение кукурузы даёт в среднем 1 г пыльцы, за вегетацию на 1 га почвы будет попадать 6 г Bt-токсина (О. А. Монастырский, 2002), который контактирует с бактериями почвы. Исследования кишечной флоры людей, получающих модифицированную сою, показали, что одна из 3 тыс бактериальных клеток включает трансгенный продукт (О.А. Разбаш и др., 2002). Источником патогенных для пчёл спироплазм являются цветки растений, с листьев растений выделен возбудитель американского гнильца. Многих патогенов пчёл в неблагополучных семьях этих насекомых устанавливают в находящихся в ульях перге и мёде. Влияние трансгенных продуктов на них остаётся неясным. Среди незапланированных эффектов трансгенов при вставке геномов энтомопатогенных вирусов в растения указывается на возможность возникновения новых патогенов, в том числе опасных для полезных насекомых (О. А. Разбаш и др., 2002). Возможность возникновения плейотропных эффектов в трансгенных растениях, распространение трансформированных генов в природе вызывает необходимость создания специальной службы слежения. Таков далеко неполный перечень проблем, подлежащих изучению в XXI веке.

 

О. Ф. Гробов, А. Н. Сотников /ВИЭВ/

Р. Т. Клочко, С. Н. Луганский /ВНИИВСГЭ/

« вернуться назад